Come si analizza la Legionella nell’acqua (coltura ISO 11731)

In breve

• Il metodo di riferimento per la ricerca della Legionella nell’acqua è la coltura su terreno selettivo, descritta dalla norma internazionale ISO 11731.
• Il campione viene prima trattato (decontaminazione termica o acida) per ridurre la crescita di altri microrganismi che disturberebbero l’isolamento.
• Segue la filtrazione su membrana, la semina su terreni selettivi e un’incubazione che può arrivare fino a circa dieci giorni.
• Le colonie sospette vengono confermate prima di essere conteggiate: solo quelle confermate concorrono al risultato finale.
• Il risultato si esprime in UFC/L (Unità Formanti Colonia per litro), la misura standard della carica batterica rilevata.
• Esistono metodi molecolari (PCR) più rapidi, utili come screening complementare ma non sempre sovrapponibili alla coltura nell’interpretazione.
• Questa pagina descrive il metodo di analisi in laboratorio: per il prelievo del campione il riferimento è la pagina dedicata al campionamento per Legionella.
• Un metodo applicato correttamente da un laboratorio accreditato riduce il rischio di risultati fuorvianti, in un ambito dove un falso negativo ha conseguenze concrete.

Questa pagina fa parte del percorso dedicato ai metodi analitici per l’acqua e approfondisce nello specifico come un laboratorio analizza un campione per la ricerca della Legionella, dal momento in cui il campione arriva in laboratorio fino al referto. Per il quadro generale sul batterio, i rischi e la prevenzione si può partire dalla guida Legionella nell’acqua; per il prelievo corretto del campione, dal campionamento per Legionella; per il quadro normativo di riferimento sull’acqua potabile, dalla normativa acqua potabile in Italia (D.Lgs. 18/2023).

Il metodo di riferimento: la coltura secondo la norma ISO 11731

In sintesi: la coltura secondo la norma ISO 11731 è il metodo analitico di riferimento per la ricerca della Legionella nell’acqua, perché isola il batterio vivo e vitale e ne permette il conteggio effettivo, non solo la rilevazione del materiale genetico. È un metodo lungo (giorni, non ore) ma è quello su cui si basano la maggior parte dei protocolli di autocontrollo e delle valutazioni tecniche in Italia.

La norma ISO 11731 descrive la procedura tecnica con cui un laboratorio deve trattare, filtrare, seminare e incubare il campione per ottenere un risultato affidabile e confrontabile tra laboratori diversi. Non è una norma di legge che fissa un valore soglia: è uno standard tecnico che garantisce la ripetibilità del metodo. I valori soglia usati per orientare le decisioni sull’impianto sono invece definiti dalle linee guida sanitarie di riferimento, non dalla norma di metodo stessa.

Le fasi dell’analisi in laboratorio, passo per passo

In sintesi: l’analisi colturale della Legionella segue una sequenza di fasi obbligate — pretrattamento del campione, filtrazione su membrana, semina su terreni selettivi, incubazione prolungata, lettura delle colonie e conferma — ciascuna necessaria per isolare in modo affidabile un batterio che cresce più lentamente di gran parte della flora acquatica concorrente.

1. Accettazione e registrazione del campione. Il laboratorio verifica che il campione sia arrivato entro i tempi e nelle condizioni indicate (temperatura, etichettatura, volume), elementi già descritti nella pagina sul campionamento per Legionella.
2. Concentrazione, se necessaria. Per volumi ampi o cariche batteriche basse, il campione può essere concentrato tramite filtrazione di un volume maggiore prima della semina, per aumentare la sensibilità della ricerca.
3. Pretrattamento di decontaminazione. Un’aliquota del campione viene sottoposta a trattamento termico (breve esposizione a temperatura elevata) o acido, per ridurre selettivamente la crescita di altri batteri che, altrimenti, colonizzerebbero il terreno più rapidamente della Legionella e ne mascherebbero la presenza.
4. Filtrazione su membrana. Il campione (trattato e non trattato) viene fatto passare attraverso una membrana filtrante che trattiene i microrganismi presenti, compresa la Legionella.
5. Semina su terreni selettivi. La membrana viene posta su terreni di coltura a base di carbone attivo e estratto di lievito, spesso addizionati con antibiotici selettivi, formulati per favorire la crescita della Legionella e sfavorire quella di altri microrganismi.
6. Incubazione. Le piastre vengono incubate a temperatura controllata, in atmosfera adeguata, per un periodo che può arrivare fino a circa dieci giorni, con controlli intermedi della crescita.
7. Lettura e conteggio delle colonie sospette. L’operatore osserva la morfologia delle colonie cresciute e seleziona quelle con caratteristiche compatibili con la Legionella.
8. Conferma delle colonie sospette. Le colonie selezionate vengono sottoposte a test di conferma (biochimici, immunologici o, in laboratori attrezzati, di identificazione più avanzata) prima di essere incluse nel conteggio finale.

Esempio pratico

Un condominio con un impianto di produzione centralizzata dell’acqua calda invia al laboratorio tre campioni prelevati da un tecnico secondo la mappa dei punti a rischio: uscita boiler, un punto di ricircolo e una doccia distale poco utilizzata. In laboratorio, ogni campione viene registrato, una parte sottoposta a pretrattamento acido e una lasciata non trattata, quindi entrambe filtrate su membrana e seminate sui terreni selettivi. Dopo alcuni giorni di incubazione compaiono su una piastra colonie con morfologia compatibile con la Legionella: vengono selezionate e sottoposte a test di conferma. Solo le colonie confermate vengono conteggiate e il risultato, espresso in UFC/L per ciascun punto, permette all’amministratore di capire se il problema riguarda l’intero impianto (per esempio un boiler con temperatura insufficiente) o si concentra in un tratto specifico, come la doccia poco usata.

Come si esprime il risultato: UFC/L e limiti del metodo

In sintesi: il risultato dell’analisi colturale della Legionella si esprime in UFC/L, cioè il numero di Unità Formanti Colonia contate per litro di campione analizzato. È una misura della carica batterica coltivabile, non una fotografia assoluta e permanente di tutto l’impianto, perché riflette il punto e il momento del prelievo.

Il valore in UFC/L viene confrontato dal committente (spesso con il supporto del laboratorio) con le soglie indicate dalle linee guida sanitarie di riferimento per orientare le decisioni sull’impianto: dalla semplice sorveglianza fino alla bonifica urgente. Il metodo colturale ha inoltre un proprio limite di rilevabilità, legato al volume di campione analizzato: più il volume filtrato è ampio, più basse sono le concentrazioni che il metodo riesce a individuare in modo affidabile.

Elemento del risultato	Cosa indica
UFC/L	Numero di colonie confermate per litro di campione: misura della carica batterica coltivabile
Specie/sierogruppo identificato	Se richiesto e se le colonie lo consentono, indica quale Legionella è presente (rilevante perché non tutte hanno lo stesso peso sanitario)
Limite di rilevabilità	Concentrazione minima che il metodo è in grado di rilevare in modo affidabile con il volume analizzato
Tempo di risposta	Legato ai giorni di incubazione necessari, non comprimibile senza perdere affidabilità

Metodi molecolari come complemento alla coltura

In sintesi: accanto alla coltura esistono metodi molecolari, come la PCR, che rilevano il materiale genetico della Legionella in poche ore anziché in giorni. Sono utili per uno screening rapido o in situazioni di emergenza, ma non distinguono sempre tra cellule batteriche vive e non più vitali, per cui non sostituiscono integralmente la coltura nell’interpretazione del rischio.

La rapidità dei metodi molecolari li rende preziosi quando serve un primo orientamento veloce, per esempio dopo una bonifica per capire se procedere subito con la riattivazione dell’impianto o attendere la conferma colturale. La coltura resta però il riferimento nella maggior parte dei contesti di autocontrollo e delle valutazioni tecniche, proprio perché conferma che il batterio rilevato è effettivamente in grado di moltiplicarsi.

Cosa trovi nel referto di laboratorio

In sintesi: un referto di analisi per Legionella riporta il punto di prelievo, la data di campionamento e di ricezione, il metodo utilizzato, il risultato in UFC/L per ciascun campione, l’eventuale specie identificata e il confronto con le soglie di riferimento indicate dalle linee guida sanitarie applicabili al contesto.

Voce del referto	Perché è importante
Punto di prelievo e data	Permette di collegare il risultato a una zona precisa dell’impianto
Metodo applicato (es. coltura ISO 11731)	Indica come è stato ottenuto il risultato e con quale affidabilità
Risultato in UFC/L	La misura quantitativa della carica batterica rilevata
Limite di rilevabilità	Necessario per interpretare correttamente un risultato "non rilevato"
Riferimento alle linee guida	Aiuta a valutare se il risultato richiede solo sorveglianza o un intervento

Domande frequenti

Qual è il metodo di riferimento per analizzare la Legionella nell’acqua?

È il metodo colturale descritto dalla norma internazionale ISO 11731: il campione viene filtrato su membrana, seminato su terreni selettivi e incubato per diversi giorni, fino alla crescita e al conteggio delle colonie sospette, poi confermate. È il metodo di riferimento perché isola il batterio vivo e vitale, non solo il suo materiale genetico.

Quanto tempo serve per avere il risultato dell’analisi della Legionella?

Il metodo colturale richiede un’incubazione che può arrivare fino a circa dieci giorni, necessaria perché la Legionella cresce più lentamente di molti altri batteri. Per questo un risultato definitivo non è mai disponibile in giornata; il laboratorio comunica i tempi indicativi al momento dell’accettazione del campione.

Cosa significa il risultato espresso in UFC/L?

UFC/L indica le Unità Formanti Colonia per litro d’acqua analizzata, cioè quante colonie di Legionella sono cresciute in coltura a partire da un litro di campione. È la misura standard con cui il referto quantifica la carica batterica rilevata.

Perché il campione viene trattato prima della semina?

Perché l’acqua contiene spesso molti altri microrganismi che crescerebbero più velocemente della Legionella e ne impedirebbero l’isolamento. I trattamenti di decontaminazione (termico o acido) e i terreni selettivi servono a favorire la crescita della Legionella riducendo la flora di disturbo.

La PCR può sostituire la coltura per la Legionella?

La PCR (un metodo molecolare) rileva il materiale genetico del batterio in poche ore, molto più rapidamente della coltura, ma non distingue sempre tra cellule vive e non vitali. Per questo è utile come screening rapido o in situazioni di emergenza, mentre la coltura resta il riferimento per la conferma e per molti contesti di autocontrollo.

Un risultato "non rilevato" significa che l’acqua è sicura al 100%?

Significa che il metodo non ha rilevato colonie sopra il proprio limite di rilevabilità nel campione analizzato, prelevato in quel punto e in quel momento. Non è una garanzia assoluta e permanente: dipende dalla correttezza del campionamento e può cambiare nel tempo se le condizioni dell’impianto (temperatura, ristagni) restano favorevoli al batterio.

Cosa succede se le colonie sospette non vengono confermate?

Alcune colonie che crescono sul terreno selettivo possono assomigliare alla Legionella ma appartenere ad altri microrganismi: per questo il laboratorio esegue test di conferma prima di refertare un risultato positivo. Solo le colonie confermate contribuiscono al conteggio finale in UFC/L.

Il metodo di analisi cambia tra acqua di rubinetto, cisterna o impianti di climatizzazione?

Il principio del metodo colturale resta lo stesso, ma il pretrattamento del campione e talvolta il volume analizzato possono variare in base al tipo di matrice e al livello di torbidità o di sostanze interferenti presenti, per garantire comunque un isolamento affidabile del batterio.

Perché serve un laboratorio accreditato per questa analisi?

Perché la ricerca della Legionella per coltura richiede terreni, tempi di incubazione e criteri di lettura precisi: un laboratorio accreditato applica il metodo sotto un sistema di qualità verificato da un ente terzo, riducendo il rischio di falsi negativi o di conteggi non affidabili.

Cosa fare se il referto riporta una presenza di Legionella?

Il referto va condiviso con chi gestisce l’impianto per avviare una valutazione del rischio e, se necessario, una bonifica mirata seguita da una nuova analisi di verifica. Per qualsiasi valutazione sui rischi per la salute delle persone esposte, il riferimento resta il medico o la ASL territoriale.

In sintesi

Il metodo di riferimento per analizzare la Legionella nell’acqua è la coltura secondo la norma ISO 11731: pretrattamento, filtrazione su membrana, semina su terreni selettivi, incubazione di diversi giorni e conferma delle colonie sospette, con risultato espresso in UFC/L. È un processo lungo ma necessario, perché isola il batterio in forma vitale e permette di distinguere un impianto realmente a rischio da un falso allarme. Per capire dove e come prelevare correttamente il campione da sottoporre a questo metodo, la pagina di riferimento è il campionamento per Legionella; per il quadro generale su rischi e prevenzione, la guida Legionella nell’acqua. Se devi organizzare un’analisi per il tuo impianto, il modo più efficace per procedere è descrivere al laboratorio il tipo di struttura e i punti critici individuati: potrai ricevere indicazioni su misura tramite la pagina richiedi analisi.