Risposta rapida
In laboratorio la ricerca di coliformi ed Escherichia coli nell’acqua si esegue soprattutto con due tecniche: il metodo a substrato enzimatico cromogeno/fluorogeno con lettura a numero più probabile (MPN), diffuso con sistemi a pozzetti pre-dosati, e la filtrazione su membrana con conta diretta delle colonie su terreno selettivo dopo incubazione. Entrambe individuano contemporaneamente la presenza di coliformi totali e, in modo specifico, di Escherichia coli, indicatore di contaminazione fecale. Il referto riporta il metodo usato, l’esito (presenza/assenza o conteggio) e il confronto con il valore di parametro del D.Lgs. 18/2023, che per l’acqua potabile richiede l’assenza in 100 mL.
Questa pagina fa parte dei metodi analitici per l’acqua usati da un laboratorio accreditato e si concentra su un aspetto specifico, spesso trascurato: come si esegue in pratica la ricerca di coliformi ed Escherichia coli in un campione, dal prelievo alla lettura strumentale. Se cerchi un inquadramento generale sul significato del parametro, la pagina di riferimento è coliformi totali nell’acqua: cos’è e perché è pericoloso; per il percorso completo di richiesta, incluso il pannello tipico, trovi analisi coliformi totali nell’acqua: metodo e costo. Qui l’obiettivo è un altro: capire nel dettaglio le due tecniche di laboratorio più usate e perché il metodo scelto conta tanto quanto il risultato numerico.
In breve
- Le due tecniche principali per cercare coliformi ed E. coli nell’acqua sono il metodo a substrato enzimatico (con lettura a numero più probabile, MPN) e la filtrazione su membrana (con conta diretta delle colonie).
- Entrambe distinguono, nello stesso test, i coliformi totali dall’Escherichia coli, indicatore specifico di contaminazione fecale recente.
- Il metodo a substrato enzimatico si basa su una reazione colorimetrica o fluorescente prodotta dagli enzimi batterici; il risultato può essere qualitativo o stimato in MPN/100 mL.
- La filtrazione su membrana filtra un volume noto di campione, incuba la membrana su terreno selettivo e conta le colonie in UFC/100 mL.
- Il campionamento asettico è un passaggio critico: un contenitore non sterile o una gestione scorretta del prelievo possono alterare il risultato indipendentemente dalla qualità del metodo.
- Entrambe le tecniche richiedono un tempo di incubazione di uno o più giorni, perché i batteri devono crescere in modo rilevabile.
- Per l’acqua destinata al consumo umano, il D.Lgs. 18/2023 richiede l’assenza di questi indicatori in 100 mL; il valore esatto e il quadro normativo completo sono descritti in normativa acqua potabile in Italia.
- Per capire la differenza tra i vari indicatori batterici prima di scegliere l’analisi, utile è anche E. coli o coliformi: differenze.
Cosa cerca davvero questo tipo di analisi
In sintesi: l’analisi non cerca "i coliformi" come minaccia diretta in sé, ma usa un gruppo di batteri facilmente rilevabili come indicatori della possibile presenza di contaminazione, in particolare di origine fecale. È un principio diverso da quello delle analisi chimiche: non si misura una sostanza pericolosa, ma un segnale di allarme igienico-sanitario.
I coliformi totali comprendono diverse specie batteriche, alcune presenti anche in ambienti naturali non necessariamente legati a contaminazione fecale. Escherichia coli, invece, vive quasi esclusivamente nell’intestino di uomini e animali a sangue caldo: la sua presenza in un’acqua che dovrebbe esserne priva è un segnale molto più specifico di contaminazione recente. Per questo un metodo analitico ben progettato deve distinguere i due esiti nello stesso test, e non limitarsi a un dato aggregato. Il tema è approfondito anche nella pagina coliformi fecali nell’acqua: cos’è e perché è pericoloso e in coliformi termotolleranti nell’acqua, utili per capire le sfumature tra le diverse famiglie di indicatori.
Le due tecniche di laboratorio più usate
In sintesi: il metodo a substrato enzimatico cromogeno/fluorogeno (con lettura a numero più probabile) e la filtrazione su membrana sono le due tecniche più diffuse per cercare coliformi ed E. coli nell’acqua. Si basano su principi diversi — reazione enzimatica la prima, crescita visibile di colonie la seconda — ma condividono lo stesso obiettivo: rilevare batteri vitali nel campione.
Il metodo a substrato enzimatico (numero più probabile, MPN)
Il campione d’acqua viene miscelato con un reagente in polvere o liquido che contiene substrati specifici per gli enzimi tipici dei coliformi e di E. coli. Se questi batteri sono presenti, i loro enzimi trasformano il substrato producendo un cambiamento di colore (per i coliformi totali) e, in presenza di E. coli, una fluorescenza rilevabile sotto luce UV. Nei sistemi più diffusi, il campione miscelato con il reagente viene poi ripartito in un vassoio con un numero definito di pozzetti di volume noto (grandi e piccoli); dopo incubazione, si contano i pozzetti positivi e negativi e si stima la concentrazione batterica con il metodo statistico del numero più probabile (MPN), espresso come MPN/100 mL.
La filtrazione su membrana
Un volume noto di campione viene fatto passare attraverso una membrana filtrante a porosità controllata, che trattiene fisicamente i batteri presenti. La membrana viene quindi posta a contatto con un terreno di coltura selettivo, in una piastra, e incubata a una temperatura controllata per un tempo definito. Al termine dell’incubazione, le colonie visibili sulla membrana vengono contate: il risultato è espresso come unità formanti colonia per 100 mL (UFC/100 mL), distinguendo le colonie tipiche dei coliformi da quelle tipiche di E. coli in base all’aspetto e, se necessario, a conferme aggiuntive.
| Tecnica | Principio | Risultato tipico | Quando è tipicamente scelta |
|---|---|---|---|
| Substrato enzimatico (MPN) | Reazione enzimatica colorimetrica/fluorescente, stima statistica | Presenza/assenza oppure MPN/100 mL | Screening rapido, acque di rete, pozzi privati, molti campioni in parallelo |
| Filtrazione su membrana | Crescita di colonie su terreno selettivo dopo filtrazione | Conteggio diretto in UFC/100 mL | Campioni con carica batterica da quantificare con precisione, conferme |
Dal prelievo del campione al risultato in referto
Il percorso operativo, a grandi linee, è comune a entrambe le tecniche, con differenze solo nella fase strumentale finale.
- Prelievo asettico. Il campione va raccolto in un contenitore sterile fornito dal laboratorio, evitando di toccarne l’interno o il bordo, dopo un’adeguata disinfezione e spurgo del punto di prelievo se si tratta di un rubinetto.
- Conservazione e trasporto. Il campione va mantenuto al fresco (catena del freddo) e consegnato al laboratorio entro tempi brevi, perché la carica batterica può variare rapidamente in condizioni non controllate.
- Preparazione in laboratorio. A seconda del metodo, il campione viene miscelato con il reagente a substrato enzimatico e ripartito nei pozzetti, oppure filtrato su membrana.
- Incubazione. Il campione preparato viene incubato a temperatura controllata per un tempo che va da uno a diversi giorni, in base al metodo e al parametro ricercato.
- Lettura del risultato. Si contano i pozzetti positivi (per il metodo MPN) o le colonie cresciute sulla membrana, distinguendo l’esito per coliformi totali e per Escherichia coli.
- Refertazione. Il tecnico riporta nel referto il metodo utilizzato, l’esito per ciascun indicatore e il confronto con il valore di parametro previsto dalla normativa.
Come si legge il risultato nel referto
In sintesi: il referto riporta, per coliformi totali ed Escherichia coli, l’esito del test (assente/presente in 100 mL, oppure un valore quantitativo in MPN/100 mL o UFC/100 mL a seconda del metodo), insieme al metodo utilizzato e al confronto con il valore di parametro normativo, che per l’acqua destinata al consumo umano richiede l’assenza di questi indicatori in 100 mL.
Un dato "assente" non significa che l’acqua sia priva di qualsiasi microrganismo, ma che il test specifico non ha rilevato gli indicatori ricercati nel volume analizzato, con il metodo e la sensibilità propri di quella tecnica. Per questo la scelta e l’applicazione corretta del metodo, da parte di un laboratorio accreditato, sono determinanti quanto il numero riportato in referto: l’accreditamento rilasciato in Italia da ente di accreditamento attesta che il laboratorio applica il metodo con competenza tecnica verificata e controlli di qualità sistematici, requisiti particolarmente rilevanti in microbiologia per limitare il rischio di falsi negativi.
Esempio pratico
Un condominio riceve una segnalazione di acqua con odore anomalo dal serbatoio di accumulo e richiede un’analisi microbiologica di verifica. Il tecnico preleva il campione in un contenitore sterile direttamente da un rubinetto rappresentativo, dopo averlo disinfettato e fatto scorrere per qualche minuto, e lo trasporta in laboratorio in una borsa termica. In laboratorio, il campione viene ripartito in un vassoio a pozzetti con reagente a substrato enzimatico e incubato per un giorno intero. Al termine, alcuni pozzetti risultano positivi al viraggio di colore (coliformi totali) e uno di questi mostra anche fluorescenza sotto luce UV, indicando presenza di Escherichia coli. Il tecnico calcola il valore MPN/100 mL sulla base del numero di pozzetti positivi e lo riporta nel referto insieme al metodo utilizzato. Il laboratorio segnala l’esito all’amministratore, che valuta con un tecnico l’origine possibile (per esempio una carenza di disinfezione del serbatoio) e, per gli aspetti igienico-sanitari, coinvolge la ASL territoriale; le opzioni di intervento sono descritte in come eliminare i coliformi totali dall’acqua: bonifica e disinfezione.
Domande frequenti
Con quale metodo si cercano i coliformi e l’E. coli nell’acqua?
I laboratori usano soprattutto il metodo a substrato enzimatico cromogeno/fluorogeno con lettura a numero più probabile (MPN), oppure la filtrazione su membrana con conta delle colonie su terreno selettivo. Entrambe le tecniche rilevano insieme coliformi totali ed Escherichia coli.
Cos’è il metodo a substrato enzimatico (tipo Colilert)?
È una tecnica in cui il campione viene miscelato con un reagente contenente substrati specifici; gli enzimi prodotti dai coliformi e da E. coli reagiscono cambiando colore o producendo fluorescenza sotto luce UV. Il campione viene poi ripartito in pozzetti e, dopo incubazione, il numero di pozzetti positivi permette di stimare la concentrazione batterica con il metodo del numero più probabile.
Come funziona la filtrazione su membrana?
Un volume noto di campione viene fatto passare attraverso una membrana filtrante che trattiene i batteri; la membrana è poi posta su un terreno di coltura selettivo e incubata. Le colonie che si sviluppano vengono contate e il risultato è espresso come unità formanti colonia per 100 mL (UFC/100 mL).
Quanto tempo serve per avere il risultato di un’analisi coliformi/E. coli?
Entrambe le tecniche richiedono un periodo di incubazione di uno o più giorni, necessario perché i batteri crescano in modo rilevabile. Il laboratorio comunica i tempi indicativi al momento della richiesta, in base al metodo e al carico di lavoro.
Che differenza c’è tra coliformi totali ed Escherichia coli nel referto?
I coliformi totali sono un gruppo ampio di batteri, alcuni presenti anche naturalmente nell’ambiente; Escherichia coli è invece un indicatore specifico di contaminazione fecale recente. Il metodo analitico distingue i due esiti nello stesso test, ed è per questo che nel referto compaiono come due righe separate.
Il risultato è sempre un numero o può essere solo presenza/assenza?
Dipende dal formato del test: alcuni kit a substrato enzimatico danno un risultato qualitativo (presente/assente in un volume definito), altri, come i sistemi a pozzetti multipli, restituiscono una stima quantitativa in MPN/100 mL. La filtrazione su membrana dà sempre un conteggio in UFC/100 mL.
Serve una preparazione particolare del campione prima dell’analisi?
Il campione va raccolto in un contenitore sterile fornito dal laboratorio, evitando qualsiasi contaminazione durante il prelievo, e consegnato in tempi brevi mantenendo la catena del freddo, perché la carica batterica può variare rapidamente se il campione non viene gestito correttamente.
Un test rapido fai-da-te sostituisce l’analisi di laboratorio per i coliformi?
No. I kit fai-da-te danno al più un’indicazione qualitativa generica e non hanno la sensibilità, la tracciabilità né i controlli di qualità di un’analisi eseguita da un laboratorio accreditato, l’unica in grado di attestare in modo affidabile la conformità al D.Lgs. 18/2023.
Serve un laboratorio accreditato per un’analisi microbiologica affidabile?
L’accreditamento, rilasciato in Italia da ente di accreditamento, attesta che il laboratorio applica il metodo scelto con competenza tecnica verificata, procedure tracciabili e controlli di qualità sistematici, elementi particolarmente importanti in microbiologia per evitare falsi negativi o falsi positivi.
Cosa devo fare se il referto segnala presenza di coliformi o E. coli?
Il dato tecnico va valutato insieme al laboratorio per capire l’origine possibile della contaminazione; per le implicazioni sulla salute, in particolare in presenza di neonati, donne in gravidanza o persone immunodepresse, il riferimento corretto è il medico curante, il pediatra o la ASL territoriale.
In sintesi
La ricerca di coliformi ed Escherichia coli nell’acqua si basa su due tecniche di laboratorio — il metodo a substrato enzimatico con lettura a numero più probabile e la filtrazione su membrana — che condividono l’obiettivo di rilevare in modo affidabile questi indicatori di contaminazione, ma differiscono nel principio e nella forma del risultato (presenza/assenza o MPN/100 mL da un lato, conteggio in UFC/100 mL dall’altro). Il campionamento asettico e l’incubazione controllata restano passaggi critici quanto la tecnica strumentale scelta. Per il quadro generale sul parametro e sui possibili rischi, riparti da coliformi totali nell’acqua: cos’è e perché è pericoloso o dalla guida analisi dell’acqua: guida completa; per il percorso pratico di richiesta, la pagina di riferimento resta analisi coliformi totali nell’acqua: metodo e costo. Per attivare un’analisi microbiologica sulla propria acqua è possibile richiedere l’analisi, indicando fonte e uso previsto.
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