Come si fa l’analisi microbiologica dell’acqua (filtrazione su membrana)

Questa pagina fa parte dei metodi analitici per l’acqua e risponde a una domanda specifica: cosa succede materialmente in laboratorio quando si esegue un’analisi microbiologica, dal campione filtrato al numero che compare sul referto. Non tratta quali parametri controllare (per quello vedi la pagina sui parametri microbiologici dell’acqua) né come si preleva il campione (vedi campionamento per l’analisi microbiologica): l’obiettivo qui è spiegare la tecnica di laboratorio, in particolare la filtrazione su membrana, così da poter leggere un referto con maggiore consapevolezza.

In breve

• La tecnica più usata per l’analisi microbiologica dell’acqua è la filtrazione su membrana: un volume noto di campione attraversa un filtro con pori microscopici che trattiene i microrganismi.
• La membrana filtrante viene appoggiata su un terreno di coltura selettivo e messa a incubare a temperatura controllata per un tempo definito.
• Dopo l’incubazione, un tecnico conta le colonie sviluppate: ogni colonia visibile corrisponde, in teoria, a un singolo microrganismo capace di moltiplicarsi.
• Il risultato si esprime in UFC (Unità Formanti Colonia) riferite al volume di campione filtrato, ad esempio UFC/100 mL.
• Terreni selettivi e cromogeni permettono di distinguere l’indicatore cercato (Escherichia coli, enterococchi intestinali) da altri microrganismi presenti nello stesso campione.
• Esistono anche metodi alternativi, come le tecniche a substrato enzimatico e il numero più probabile, usati in casi specifici.
• La qualità del risultato dipende tanto dal metodo di laboratorio quanto dalla correttezza del prelievo: un campione contaminato in fase di raccolta può alterare l’esito indipendentemente dalla tecnica usata.
• Per il quadro normativo di riferimento vale il D.Lgs. 18/2023; per un inquadramento generale sull’acqua potabile la guida di riferimento è acqua potabile: cosa significa e quando è sicura da bere.

Cos’è la filtrazione su membrana

In sintesi, la filtrazione su membrana è la tecnica di laboratorio che fa passare un volume noto di campione d’acqua attraverso un filtro con pori microscopici, capace di trattenere in superficie i microrganismi presenti; la membrana viene poi trasferita su un terreno di coltura per farli crescere e contarli come colonie visibili.

Il principio è semplice ma efficace: i pori della membrana filtrante hanno un diametro tale da trattenere batteri e altri microrganismi, lasciando invece passare l’acqua. Al termine della filtrazione, sulla superficie della membrana restano intrappolati tutti i microrganismi presenti nel volume filtrato. La membrana viene quindi prelevata con una pinza sterile e posata su una piastra contenente un terreno di coltura specifico per il parametro cercato. Da questo momento, ogni microrganismo vitale trattenuto sulla membrana ha a disposizione i nutrienti necessari per moltiplicarsi, formando nel tempo una colonia visibile a occhio nudo.

Le fasi dell’analisi, dal campione alla colonia

In sintesi, l’analisi microbiologica per filtrazione su membrana si sviluppa in fasi sequenziali: accettazione del campione, filtrazione, posizionamento su terreno selettivo, incubazione a temperatura controllata e infine lettura e conteggio delle colonie sviluppate.

1. Accettazione del campione. Il laboratorio verifica l’integrità del contenitore, la temperatura di arrivo e il tempo trascorso dal prelievo; un campione arrivato fuori dai tempi o dalle condizioni previste può compromettere l’affidabilità del risultato, indipendentemente dalla qualità del metodo.
2. Eventuale diluizione. Se si prevede una carica microbica molto elevata (ad esempio in acque non trattate), il campione può essere diluito con acqua sterile, per evitare che le colonie si sovrappongano sulla membrana e rendano il conteggio impreciso.
3. Filtrazione. Un volume noto di campione, spesso 100 mL per gli indicatori fecali nell’acqua potabile, viene fatto passare attraverso la membrana filtrante sotto vuoto, trattenendo in superficie i microrganismi presenti.
4. Posizionamento su terreno selettivo. La membrana viene trasferita con una pinza sterile su una piastra Petri contenente un terreno di coltura scelto in base al microrganismo cercato: terreni diversi favoriscono la crescita di batteri diversi e, spesso, includono indicatori cromogeni o fluorogeni che aiutano a riconoscere il microrganismo bersaglio.
5. Incubazione. Le piastre vengono poste in incubatore a temperatura e per un tempo definiti, tipicamente tra 24 e 48 ore; la temperatura scelta è parte della selettività del metodo, perché favorisce la crescita del microrganismo cercato rispetto ad altri.
6. Lettura e conteggio. Al termine dell’incubazione un tecnico conta le colonie sviluppate sulla membrana, riconoscendole per colore, forma o fluorescenza in base al terreno usato, ed esprime il risultato come numero di Unità Formanti Colonia (UFC) riferito al volume di campione filtrato.
7. Conferma, se necessaria. Nei casi dubbi, alcune colonie possono essere sottoposte a test biochimici o enzimatici di conferma prima che il risultato venga refertato in modo definitivo.

Esempio pratico

Un campione di acqua di pozzo viene consegnato in laboratorio la mattina, entro poche ore dal prelievo. Il tecnico filtra 100 mL di campione attraverso una membrana, la posa su un terreno selettivo per Escherichia coli e la mette a incubare a temperatura controllata. Il giorno seguente, sulla membrana si osservano due colonie con la colorazione tipica dell’indicatore cercato: il referto riporterà quindi un valore pari a 2 UFC/100 mL per Escherichia coli, un dato che il laboratorio confronterà con il valore di parametro del D.Lgs. 18/2023, che per questo indicatore richiede l’assenza in 100 mL. Un risultato diverso da zero, in questo contesto, segnala una contaminazione da approfondire.

Altre tecniche usate in microbiologia dell’acqua

In sintesi, oltre alla filtrazione su membrana esistono altre tecniche per la ricerca di microrganismi nell’acqua, come i metodi a substrato enzimatico/cromogeno e il numero più probabile (MPN): la scelta dipende dal parametro cercato, dalla matrice e dall’organizzazione del laboratorio.

Metodo	Principio generale	Contesto d’uso tipico
Filtrazione su membrana	Filtro trattiene i microrganismi, poi coltura e conteggio colonie	Indicatori fecali in acqua potabile, ampia diffusione
Substrato enzimatico/cromogeno	Reazione colorimetrica o di fluorescenza in provetta o micropiastra al metabolismo del microrganismo cercato	Screening rapido di Escherichia coli e coliformi
Numero più probabile (MPN)	Stima statistica basata su serie di provette positive/negative dopo incubazione	Matrici particolari o quando la filtrazione non è applicabile

Perché conta l’accreditamento del laboratorio

In sintesi, l’accreditamento secondo la norma di riferimento per i laboratori di prova, rilasciato in Italia da ente di accreditamento, non riguarda l’esistenza della tecnica in sé ma attesta che il laboratorio la applica con competenza tecnica verificata, strumentazione controllata e un sistema di gestione della qualità documentato e sottoposto a verifiche periodiche.

Questo significa, in pratica, che un laboratorio accreditato dimostra la tracciabilità di ogni fase: dalla taratura degli strumenti di incubazione alla qualità dei terreni di coltura utilizzati, fino alla formazione del personale che esegue lettura e conteggio delle colonie. Per parametri sensibili come quelli microbiologici, dove un errore in una singola fase può alterare in modo significativo il risultato, questi controlli sono un elemento importante di affidabilità del referto, distinto — è bene ricordarlo — dal concetto di "acqua certificata", espressione impropria: è il laboratorio a essere accreditato per una prova, non l’acqua o il singolo risultato.

Domande frequenti

Qual è il metodo più usato per l’analisi microbiologica dell’acqua?

La filtrazione su membrana è la tecnica più diffusa: fa passare un volume noto di campione attraverso un filtro che trattiene i microrganismi, i quali vengono poi coltivati su un terreno selettivo e conteggiati come colonie.

Quanto tempo serve per avere il risultato di un’analisi microbiologica?

In genere da 24 a 48 ore, il tempo necessario ai microrganismi trattenuti sulla membrana per moltiplicarsi in colonie visibili durante l’incubazione. Alcuni parametri o conferme possono richiedere qualche giorno in più.

Cosa vuol dire UFC nel referto microbiologico?

UFC significa Unità Formanti Colonia: ogni colonia visibile sulla membrana dopo incubazione deriva, in teoria, da un singolo microrganismo capace di moltiplicarsi. Il risultato si esprime come numero di UFC riferito al volume di campione filtrato.

La filtrazione su membrana è l’unico metodo per la microbiologia dell’acqua?

No. Sono utilizzate anche tecniche a substrato enzimatico/cromogeno (in provetta o piastra) e metodi del numero più probabile; la scelta dipende dal parametro, dal laboratorio e dallo scopo di accreditamento, ma la filtrazione su membrana resta la più diffusa per le acque destinate al consumo umano.

Perché il laboratorio incuba i campioni a temperature diverse?

Temperature di incubazione diverse selezionano gruppi microbici diversi: ad esempio Escherichia coli ed enterococchi richiedono condizioni specifiche, mentre il conteggio delle colonie a 22 e 37 gradi valuta la flora microbica generale a temperatura ambiente e corporea.

Come fa il laboratorio a essere sicuro che una colonia sia davvero Escherichia coli?

I terreni selettivi e cromogeni fanno reagire in modo caratteristico i microrganismi cercati, cambiando colore o fluorescenza della colonia; nei casi dubbi si eseguono test di conferma biochimici o enzimatici prima di refertare il risultato.

L’analisi microbiologica può dare un falso positivo?

Sì, soprattutto per errori nel campionamento (contenitore non sterile, contaminazione durante il prelievo) più che nel metodo di laboratorio in sé. Per questo la procedura di prelievo asettica è determinante quanto l’analisi strumentale.

Cosa succede al campione prima di arrivare alla filtrazione?

Il campione viene registrato, controllato per integrità del contenitore e temperatura di arrivo, ed eventualmente diluito se si prevede una carica microbica molto elevata, per ottenere un conteggio di colonie leggibile sulla membrana.

Il metodo di analisi microbiologica è uguale per acqua potabile e acqua di piscina?

Il principio di base, filtrazione e coltura, è simile, ma cambiano i parametri ricercati e i terreni utilizzati, perché le due matrici hanno indicatori microbiologici di riferimento diversi legati al rispettivo uso.

Un laboratorio accreditato usa metodi diversi da uno non accreditato?

L’accreditamento non riguarda l’esistenza del metodo in sé, ma attesta che il laboratorio lo applica con competenza tecnica verificata, strumentazione controllata e un sistema di qualità documentato, elementi che aumentano l’affidabilità del risultato.

In sintesi

Capire come funziona la filtrazione su membrana aiuta a leggere un referto microbiologico con più consapevolezza: un numero di UFC/100 mL non è un dato astratto, ma il conteggio diretto di colonie cresciute da un volume noto di campione, ottenuto con una procedura tracciabile in ogni fase. Se vuoi approfondire quali parametri vengono generalmente ricercati, la pagina sui parametri microbiologici dell’acqua è il punto di partenza; se invece devi organizzare un prelievo, la guida al campionamento per l’analisi microbiologica spiega come evitare gli errori più comuni. Per richiedere un’analisi microbiologica con il supporto di un laboratorio accreditato, puoi partire da una richiesta di analisi, indicando la fonte dell’acqua e l’uso previsto.